je zkratka pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii, špičkovou přístrojovou techniku, která slouží k oddělení složek vzorku, aby stanovila jejich přítomnost a koncentraci, popřípadě izoluje jednotlivé složky směsi.
Chromatografie sama o sobě je pak souhrnným označením pro skupinu fyzikálně-chemických separačních metod. Molekuly látek, prvků či iontů se u všech typů chromatografických separací rozdělují mezi stacionární (stálou, neměnící se s časem) a mobilní fázi. Dělení je založené na rozdílné distribuci složek směsi mezi mobilní a stacionární fázi. V kapalinové chromatografii je mobilní fází kapalina.
Zkratka HPLC-MS/MS pak vyjadřuje propojení kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní spektometrií. Tímto špičkovým systémem disponuje také Laboratoř environmentální chemie a biochemie Fakulty rybářství a ochrany vod ve Vodňanech.
Pomocí HPLC-MS/MS je možné řešit tyto úkoly:
HPLC-MS/MS představuje složitý systém, který se skládá z pěti hlavních částí. Těmi jsou:
HPLC slouží v oblasti životního prostředí například ke stanovení antibiotik v mase ryb.
Jejich nadměrné použití v průmyslové akvakultuře vede k přítomnosti zbytkových antibiotik v rybách, které jsou určené ke konzumaci. To má škodlivé účinky na lidské zdraví a životní prostředí - bakterie, které jsou patogenní pro člověka, jsou kvůli tomu vůči antibiotikům odolnější.
Pro demonstraci toho, jak pomocí HPLC-MS/MS stanovíme koncentraci antibiotik, nám poslouží tento vzorek rybí tkáně
Následně se přidá vnitřní standard (roztok deuterovaných analogů cílových sloučenin). Je to nejvhodnější metoda pro výpočet koncentrací cílových analytů ve vzorku ryby
Vakuová nádoba pro extrakci a přečištění vzorku – Za použití vakua projdou malé cílové molekuly (např. léčiv) přes čistící vrstvu, zatímco vysrážené bílkoviny a fosfolipidy se na ní zachytí. Tento krok je důležitý pro konečnou analýzu na HPLC-MS/MS, protože fosfolipidy a proteiny mohou ovlivnit výsledky nebo i znemožnit vlastní stanovení výsledků
Zapíšeme sekvenci pro přístrojovou analýzu (pořadí vzorků, jejich název, co chceme analyzovat atd.)
Po přepnutí ventilu dochází k naplnění smyčky na požadovaný objem. Po opětovném přepnutí ventilu je proudem mobilní fáze vzorek vytlačen na analytickou kolonu.
Analytické čerpadlo žene vzorek na analytickou kolonu proudem rozpouštědla (mobilní fáze).
Při gradientové eluci se mísí dvě nebo více čistých mobilních fází podle programu ve směšovači. Zároveň je možné vhodnou volbou gradientu optimalizovat rozdělení mnohosložkových směsí.
Skleněné láhve s přívodní kapilárou z polytetrafluorethylenu a filtrační fritou. Je možné používat až čtyři různé složky pro vytvoření mobilní fáze.
Analytická kolona se používá pro separaci cílových analytů. Rozdělení vzorku na jednotlivé složky (analyty) probíhá na základě rozdílné distribuce mezi mobilní a stacionární fázi. Klasická HPLC kolona je trubka z kovového pláště (nerezová ocel) naplněná stacionární fází. Tato náplň je tvořena kulovitými částicemi s průměrem 3-5 µm.
Rozdílné analyty (dělené látky) mají rozdílnou schopnost slučovat se se stacionární fází. Při postupu vzorku kolonou se jednotlivé složky vzorku (analyty) dělí - dospějí do detektoru v různých časech.
Prvním krokem detekce je převod analytů rozpuštěných v mobilní fázi na ionty v plynné fázi. Tento proces probíhá v iontovém zdroji za atmosférického tlaku. Ionty vznikají v důsledku postupného odpaření rozpouštědla v elektrickém poli.
Ionty ze zdroje jsou dále transportovány iontovou optikou k dalším součástem hmotnostního spektrometru. Elektrosprej je nejčastěji používaný iontový zdroj v LC/MS. Elektrosprej je vhodný pro polární i iontové látky, peptidy, proteiny sacharidy, nukleové kyseliny, organometalické i anorganické komplexy.
Hmotnostní spektrometr umožňuje detekci nabitých částic v závislosti na poměru hmotnosti ku náboji (m/z). Je to univerzální a zároveň vysoce selektivní, citlivý detektor. Umožňuje identifikaci analytů na základě jejich hmotnostních spekter.
Chromatogram – záznam z chromatografu znázorňující jednotlivé analyty ve formě chromatografických píků.
Zahrnuje integrace chromatografických píků a výpočet koncentrací.
V případě výše uvedeného chromatogramu jde o vyhodnocení vzorku pangase chovaneho ve Vietnamu. Ten obsahuje 9,04 µg/kg antibiotika Flumequinu, což je mnohem méně než bezpečnostní limit platný v Evropské unii (600 µg/kg). Další vzorek je pstruha duhového ze Španělska, který obsahuje 14,6 µg/kg antibiotik Trimetoprimu a 10,3 µg/kg Erytromycinu, což je též méně, než jaký je stanovený limit.