Kapalinová chromatografie

co to je a k čemu slouží?

HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

je zkratka pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii, špičkovou přístrojovou techniku, která slouží k oddělení složek vzorku, aby stanovila jejich přítomnost a koncentraci, popřípadě izoluje jednotlivé složky směsi.

Chromatografie sama o sobě je pak souhrnným označením pro skupinu fyzikálně-chemických separačních metod. Molekuly látek, prvků či iontů se u všech typů chromatografických separací rozdělují mezi stacionární (stálou, neměnící se s časem) a mobilní fázi. Dělení je založené na rozdílné distribuci složek směsi mezi mobilní a stacionární fázi. V kapalinové chromatografii je mobilní fází kapalina.

Této techniky se používá při:

  • kontrole kvality v chemické syntéze
  • kontrole kvality potravin a kosmetiky
  • vývoji nových léčiv
  • stanovení chemických látek v životním prostředí
  • analýze peptidů, proteinů a polynukleotidů (proteomika, peptidomika, metabolomika atd.)

Zkratka HPLC-MS/MS pak vyjadřuje propojení kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní spektometrií. Tímto špičkovým systémem disponuje také Laboratoř environmentální chemie a biochemie Fakulty rybářství a ochrany vod ve Vodňanech.

Pomocí HPLC-MS/MS je možné řešit tyto úkoly:

  • Identifikovat potravinářská aditiva v různých potravinářských výrobcích
  • Analyzovat polutanty v sedimentech, vodě nebo rybách
  • Stanovit drogy a jejich metabolity v moči

HPLC-MS/MS představuje složitý systém, který se skládá z pěti hlavních částí. Těmi jsou:

  • autosampler (robotický dávkovač) - zařízení pro dávkování vzorku
  • vysokotlaké čerpadlo - zařízení pro uchovávání a transport mobilní fáze
  • analytická kolona - zařízení pro separaci látek
  • detektor - zařízení pro měření odezvy signálu analytů
  • počítač - umožnuje provoz systému a zpracování dat

HPLC slouží v oblasti životního prostředí například ke stanovení antibiotik v mase ryb.

Jejich nadměrné použití v průmyslové akvakultuře vede k přítomnosti zbytkových antibiotik v rybách, které jsou určené ke konzumaci. To má škodlivé účinky na lidské zdraví a životní prostředí - bakterie, které jsou patogenní pro člověka, jsou kvůli tomu vůči antibiotikům odolnější.

Analýza vzorku pomocí HPLC-MS/MS

Pro demonstraci toho, jak pomocí HPLC-MS/MS stanovíme koncentraci antibiotik, nám poslouží tento vzorek rybí tkáně

Vzorek nakrájíme na malé kousky
Navážíme ho do vialky na analytických vahách
Analytické váhy slouží pro vážení malých vzorků s velmi vysokou přesností (0,01 mg).

Následně se přidá vnitřní standard (roztok deuterovaných analogů cílových sloučenin). Je to nejvhodnější metoda pro výpočet koncentrací cílových analytů ve vzorku ryby

Přidáme extrakční rozpouštědlo (Acetonitril) pro izolaci látek z rybí tkáně

Dalším krokem je extrakce vzorků

Tissuelyzer se používá k homogenizaci a zároveň extrakci vzorku tkáně. Umožňuje homogenizace až 42 vzorků současně. Vlastní proces je založen na rozbití tkáně s použitím kovových kuliček při frekvenci 30 000 třepnutí za minutu.

Odstředění vzorku

Odstředivka - laboratorní přístroj určený především k oddělení složek směsi pomocí odstředivé síly. Rybí tkáň se usadí na dně, zatímco roztok s látkami, které nás zajímají, zůstane nad ní.

Filtrace vzorku

Filtry z regenerované celulózy se používají k odstranění jemných částic z tkáně vzorku.

Přečištění vzorku

dosáhneme tak odstranění nežádoucích sloučenin z roztoku

Vakuová nádoba pro extrakci a přečištění vzorku – Za použití vakua projdou malé cílové molekuly (např. léčiv) přes čistící vrstvu, zatímco vysrážené bílkoviny a fosfolipidy se na ní zachytí. Tento krok je důležitý pro konečnou analýzu na HPLC-MS/MS, protože fosfolipidy a proteiny mohou ovlivnit výsledky nebo i znemožnit vlastní stanovení výsledků

Extrakt převedeme do chromatografické vialky
Umístíme vialku do robotického dávkovače

Autosampler

Robotický dávkovač je spojený se zásobníkem vzorků, ve kterém jsou umístěny vialky. Vzorek se nabírá stříkačkou a je dávkován pomocí smyčky na šesticestném ventilu.

Zapíšeme sekvenci pro přístrojovou analýzu (pořadí vzorků, jejich název, co chceme analyzovat atd.)

Dále dochází k nástřiku vzorku do systému LC-MS/MS

injector

Po přepnutí ventilu dochází k naplnění smyčky na požadovaný objem. Po opětovném přepnutí ventilu je proudem mobilní fáze vzorek vytlačen na analytickou kolonu.

Analytické čerpadlo

Analytické čerpadlo žene vzorek na analytickou kolonu proudem rozpouštědla (mobilní fáze).

Při gradientové eluci se mísí dvě nebo více čistých mobilních fází podle programu ve směšovači. Zároveň je možné vhodnou volbou gradientu optimalizovat rozdělení mnohosložkových směsí.

Zásobníky mobilních fází

Skleněné láhve s přívodní kapilárou z polytetrafluorethylenu a filtrační fritou. Je možné používat až čtyři různé složky pro vytvoření mobilní fáze.

Dochází k separaci cílových chemických sloučenin

Analytická kolona se používá pro separaci cílových analytů. Rozdělení vzorku na jednotlivé složky (analyty) probíhá na základě rozdílné distribuce mezi mobilní a stacionární fázi. Klasická HPLC kolona je trubka z kovového pláště (nerezová ocel) naplněná stacionární fází. Tato náplň je tvořena kulovitými částicemi s průměrem 3-5 µm.

Rozdílné analyty (dělené látky) mají rozdílnou schopnost slučovat se se stacionární fází. Při postupu vzorku kolonou se jednotlivé složky vzorku (analyty) dělí - dospějí do detektoru v různých časech.

ionizace

Prvním krokem detekce je převod analytů rozpuštěných v mobilní fázi na ionty v plynné fázi. Tento proces probíhá v iontovém zdroji za atmosférického tlaku. Ionty vznikají v důsledku postupného odpaření rozpouštědla v elektrickém poli.

Ionty ze zdroje jsou dále transportovány iontovou optikou k dalším součástem hmotnostního spektrometru. Elektrosprej je nejčastěji používaný iontový zdroj v LC/MS. Elektrosprej je vhodný pro polární i iontové látky, peptidy, proteiny sacharidy, nukleové kyseliny, organometalické i anorganické komplexy.

Detekce cílových sloučenin

Hmotnostní spektrometr umožňuje detekci nabitých částic v závislosti na poměru hmotnosti ku náboji (m/z). Je to univerzální a zároveň vysoce selektivní, citlivý detektor. Umožňuje identifikaci analytů na základě jejich hmotnostních spekter.

 

Chromatogramy - kvalitativní zpracování dat

Chromatogram – záznam z chromatografu znázorňující jednotlivé analyty ve formě chromatografických píků.

Kvantifikace dat

Zahrnuje integrace chromatografických píků a výpočet koncentrací.

Vyhodnocení výsledků

V případě výše uvedeného chromatogramu jde o vyhodnocení vzorku pangase chovaneho ve Vietnamu. Ten obsahuje 9,04 µg/kg antibiotika Flumequinu, což je mnohem méně než bezpečnostní limit platný v Evropské unii (600 µg/kg). Další vzorek je pstruha duhového ze Španělska, který obsahuje 14,6 µg/kg antibiotik Trimetoprimu a 10,3 µg/kg Erytromycinu, což je též méně, než jaký je stanovený limit.

Slovníček

  • Aditivum - látky přidávané do výrobků k zlepšení nebo jiné úpravě jejich vlastností, přísady
  • Polutant - znečišťující, odpadní látka
  • Metabolit - produkt látkové přeměny (metabolismu)
  • Vialka - injekční lahvička
  • Analyt - konkrétní látka, prvek, ion, funkční skupina, nebo jejich kombinace ve vzorku, jehož přítomnost nebo množství je určováno metodami analytické chemie
  • Fosfolipidy - patří mezi tuky (tedy lipidy) obsahující fosfor a jsou hlavní částí všech buněčných membrán
  • Proteiny - bílkoviny
  • Mobilní fáze - jako mobilní fáze se používá směs polárních rozpouštědel: voda-metanol, voda-acetonitril, voda-isopropylalkohol
  • Eluce - vyluhování, vymývání látek
  • Gradien - postupná změna intenzity faktoru na jednotku délky, např. nárůst nebo pokles teploty, vlkosti, salinity atd. v určitém prostoru
  • Gradientová eluce - je zjednodušeně řečeno nejpoužívanější a neúčinnější technikou změny selektivity na analytické koloně. Při gradientové eluci se pracuje s mobilní fází, jejíž složení se mění s časem, takže v průběhu separace dochází ke zvyšování její eluční síly
  • Polytetrafluorethylen - flourovaný polymer, známý více pod obchodním názvem teflon
  • Frity - tenké skleněné nebo porcelánové trubičky, obvykle zatavené do skleněných filtračních kelímků nebo nálevek
  • Ion (iont) - jsou elektricky nabité částice atomární velikosti (atomy, molekuly, někdy také skupiny atomů či molekul)
  • Pík - křivka zvonovitého tvaru znázorňující závislost dvou proměnných veličin, například odezvy detektoru na koncentraci dělené látky v chromatografii (chromatografická vlna)